Курстық жұмыс: Биология | Бидай тозаңқабынан гаплоидтық өсімдіктер алу

Кіріспе 4
1. Әдебиеттік шолу 6
1.1. Өсімдіктердегі гаплоидия 6
1.2 .Гаплоидия терминологиясы 6
1.3. Аталық гаметофиттерден клеткалар культурасынан гаплоидтарды алу. 9
1.4 .Донорлы өсімдіктердің өсу жағдайлары 10
1.5. Гүл шоғырларын сақтау мен оларды алдын ала өндеу 12
1.6. Каллус пен эмбриоид индукциясы үшін қоректік ортаның құрамы 13
1.7. Оқшауланган аталық гаметофит культурасындағы клеткалық бөлінудің ерекшеліктері 14
1.8. Өсімдіктердің регенерациясына арналған қоректік ортаның құрамы
15
1.9. Гаплоидтардың хромосомды жиынтығының екі еселенуі 18
2. Негізгі бөлім 22
2.1. Зерттеу материалдары мен әдістері
22
2.6. Регенеранттарды кариологиялық зерттеу әдісі
23
2.5. Тозаңқап культурасындағы бидай регенерациясы 24
Қорытынды 26
Қолданылған әдебиеттер тізімі 28
КІРІСПЕ
Гаплоидтар ауыл шаруашылық дақылдарды генетикалық сандық талдаудан өткізгенде де пайдаланады. Гаплоидтық өсімдіктерде рецессивтік гендік мутацияларды анықтау оңай, себебі олар доминанттық аллельдермен бүркелмейді. Бұл селекция процесін жылдамдатуға көмектеседі. Солтүстік Қазақстанға тез пісіп жетілетін бидай сорттарын алу актуалды болып табылады. Әріден будандастыру арқылы алынған тез пісіп жетілетін бидай будандардың гаплоидтарын алып, олардың дигаплоидтарынан тұрақты гомозиготалық сорттарды шығару маңызды болып табылады.Әріден будандастырғанда түраралық, туысаралық, тіпті буданаралық будандастыру нәтижесінде гетерозис құбылысы орын алады. Ал дигаплоидтарды алу арқылы гетерозисты сақтап қалуға болады. Осындай жұмыстар Шортандыдағы Ғылыми Өндірістік Орталықтың жаздық бидай бөлімінде бидайдың тез жетілетін сорттарын алу үшін жүргізілген. Екі еселенген гаплоидтардың негізінде гетерозистық будандарды алу үшін қажетті изогендік линияларын бір жылдың ішінде шығаруға болады, ал әдеттегідей инбридинг әдісімен бұған 4-6 жыл кетеді.
Сондықтан жұмыстың мақсаты болып тез жетілетін бидайдың гетерозистық будандарынан гаплоидтық өсімдік регенеранттарын алу.
Жұмыстың міндеттері: 1. Аталық гаметофиттерінің клеткалар культурасынан гаплоидтарды алу туралы әдебиеттік шолу жасау.
2. Тез жетілетін бидай будандарының каллусогенезі мен эмбриогенезін зерт-теу.
1. Әдебиеттік шолу
1.1. Өсімдіктердегі гаплоидия
Алғашқы гаплоидты өсімдікті 1922 ж. А.Ф. Блексли экспериментальды түрде Datura Stramonium – нан алды. Бұл гаплоидия саласында келесі зерт-теулер перспективасында ғана емес, сонымен қатар өсімдіктер селекциясын-да практика жүзінде де қолдануға түрткі болды. Сол кездің өзінде – ақ гаплоидтардан гомозиготалы диплоидты линия алу туралы ойлар айтылған [5] кейіннен Р.А. Моррисон экспериментальді жолмен алынған гаплоидты өсімдіктен томаттың гомозиготалы линиясын алды. Осылайша, теоретикалық болжамның дұрыстығы практикада дәлелденеді. Бұл саладағы бұдан кейінгі зерттеулер негізінен гаплоидия құбылысын селекция жұмыстарында бағытталды.
Табиғатта гаплоидтардың пайда болуы – белгілі құбылыс. Әр түрлі сис-тематикалық топтардағы кездейсоқ гаплоидтардың кездесуін талдау олардың әр түрлі жиілікпен қалыптасатынын көрсетті. Гаплоидтар қалыптасуының жиілігі дәнді дақылдарда және алқалар, лалагүлдер тұқымдастықтарында кездесетіні байқалды. Бірақ гаплоидтардың кездейсоқ қалыптасуының жиілігі өте төмен 1х10-5– 1х10-6 [6]. Осыған байланысты гаплоидтарды алу үшін әртүрлі тәсілдерге негізделген экспериментальді әдістер қолданылады: қосарлы ұрықтарды сұрыптау, түрарлық шағылыстыру, химиялық әдіс, in vitro жағдайында аталық немесе аналық гаметофитті өсіру.
Гаплоидтарды алудың ең белгілі дәстүрлі әдісі – алшақ будандарды қолдану. Гаплоидизация тек физиологиялық бөтен тозаңның спермиялары-ның біреуі жұмыртқа клеткасына енген соң ары қарай дамымаған жағдайда ғана болады. Осының салдарынан гаметалар қосылмайды, бірақ жұмыртқа клеткасының дамуына ықпал болады. Екінші спермия әдетте, орталық ядромен қосылып, қалыпты эндоспермаға бастау береді.
Гаплоидтар алшақ будандастыру нәтижесінде қалыптасуының басқа жолы, ол тозаңдану кезінде екі спермиясының ядролары байланыста болады да, екеуі бірдей не жұмыртқа клеткаларымен, не орталық ядромен қосылады. Бұл жол Solanum tuberosum гаплоидтарында оны картоптың кейбір жабайы түрлерімен тозаңдандырғанда дәлелденген. Осылайша, Р. Лэмм дигаплоидты (2n =24) мәдени картопты S chaucha тозаңымен тозаңдандырып алған [7].
Е.В. Ивановская дигаплоидтарды Solanum tuberosum мен Аврора сортын S. Phureja шағылыстыру жолымен алған [8]. Дигаплоид партеногенетикалық немесе андрогенетикалық жолмен – жұмыртқа клеткасының ядросының дегенерациясы негізінде пайда болады деп жорамалдайды.
Қосарлылық тәсіл гаплоидты қосарлы ұрықтарды табу мен сұрыптауға негізделген. Қосарлы деп бір тұқымнан өскен дербес өсімдіктер жұбын немесе тобын атайды. Гаплоидты егіздердің шығуы туралы әртүрлі пікірлер бар. К. Рамих әріптестерімен [9] және С. Харланд [10] олардың пайда болуын бір тұқымбүршікте екі немесе бірнеше ұрықтық қалтаның қалыптасумен, екінші біріншісінің физиологиялық әсерімен ұрықтанбай дами беретіндігімен түсіндіреді. Басқа түсініктемеде, гаплоидты қосарлы ұрықтың синергид немесе антиподтан қалыптасуы нәтижесінде пайда болуына байланысты делінген [11]. Қосарлы ұрықтың пайда болуының екі жолы да іске асатын болуы мүмкін. Бұдан басқа, қосарлылылық бір ұрықтың эмбриогенездің бастапқы кезеңінде 2-ге бөлінуі нәтижесінде қалыптасуы мүмкін [12].
Гаплоидтарды алудың келесі тәсілі иондаушы радиацияны пайдалану болып таблады. Тозаңды рентгенді сәулелендіру нәтижесінде аталық гамета-лар инактивтеленеді немесе жұмыртқа клеткаларымен қосылу қабілетінен ай-ырылады, бірақ, оған қарамастан жұмыртқа клеткасыннан гаплоиды ұрық қалыптастыратын бөлінуге ынталандырады. Осы тәсілді қолданып, картоп [13] пен пияз [14] гаплоидтары алынған. Гаплоитарды химиялық әсерлердің көмегімен алу мүмкіндігі де көрсетілген [15]. Сонымен бірге, гаплоидтардың пайда болуына жыныс клеткасына экстремальды температуралармен әсер ету де ықпал етеді. Бұл кезде жұмыртқа клеткасының аталық гаметамен қосылмай, партеногенетикалық дамуға қабілетті ортада темекі гаплоидын алу үшін жоғарғы, ой дурман үшін – төменгі оң температура қажет екендігі анықталған [16,17].
Гаплоидтарды алудағы үлкен жетістіктер клетканы ұлпа мен мүшені жасанды ортада өсіру тәсілдері меңгерілген соң болды. Микроспорогенез және макроспорогенез саласындағы зерттеулер [18], сонымен қатар оқшауланған ұлпалар культурасының теоретикалық аспектілерін тағайындаудағы жетістіктер [19,20] оқшауланған аталық және аналық гаметофиттерді пайдалана отырып: тозаң немесе микроспоралардан, ұрықтанбаған түйін және тұқымбүрлерден экспериментальді жолмен гаплоидтарды in vitro жағдайында алудың жалпы принциптерін тағайындау мүмкіндік берді. Бұл жағдайда өсімдіктердің регенерациясы гаметофиттің гаплоидты клеткалары, сыртқы орта әсерлерінің нәтижесінде даму жолын – гаметофиттік жолдан спорофиттік жолға ауыстыруға қабілеттілігіне негізделеді.
In vitro жағдайын қолдана отырып гаплоидты алудың басқа жолы ата – ананың біреуінің хромосомаларының алшақ будандастырудан соң (гаплопродюсер) хромосомаларды жойып жіберу қасиетіне негізделеді. Элиминация нәтижесі болып жыныс клеткасында хромосомалардың гаплоидты жиынтығы қалады. Бұл кезде жыныс клеткасы ұрық қалыптасқанша дами береді. Бірақ мұндай ұрық өзінің ары қарайғы өсуі үшін қоректі заттарды қажет етеді, себебі алшақ будандастыру кезінде, әдетте, эндосперм қалыптаспайды. Осыған байланысты гаплоидты ұрықтарды белгілі құрамды қоректік ортаға көшіріледі де, ары қарай жасанды(in vitro) жағдайда ересек өсімдік алынғанша өсіреді. Гаплопродюсер болып бір туыстың өкілдері, мәселен, пияз текті арпа (Hordeum bulbozum) мәдени арпа үшін (Hordeum vulgare), сонымен қатар жұмсақ бидай үшін (Triticum aestivum) африкалық тарының (Pennisetum glaucum) әр түрлі туыстары табылады.
Қазіргі кезде жүгеріден «индукторлары» – жүгері линиялары табылған, олармен шағылыстырғанда хромосомалары гаплоидтық жиынтықтағы тұқымдардың жиілігі 6 – 7% – ке кейбір жағдайларда 30% – ке жетеді. Мұнда гаплоидтық өсімдік алу in vitro жағдайында өсіру кезеңін қажет етпейді. Алынған гаплоидты өсімдіктер генетикалық зерттеулерде кеңінен қолданылуда, әсіресе жүгері геномын картаға түсіруде.
Көптеген мәдени өсімдіктер, әдетте полиплоидты болып табылады. Сондықтан in vitro жағдайында тәжірбиелік жолмен алынған мәдени өсім-діктердің гаплоидты регенеранттары шын мәнінде гаплоидты болып табыл-майды. Мәселен, жұмсақ бидай (Triticum aestivum). – Аллополиплоид (2n = 6x = 42) – A, B және Д геномдары бірігуінің нәтижесі, ал гаплоидты жағдайында олардың әрқайсысында жеті (х = 7) хромосомадан бар. Бір геномды арпа (Hordeum vulgare) – автотетраплоид (2n =4х = 48) болып табылады.
Картоп (Solanum tuberosum), ол да – автотетраплоид (2n =4х = 48). Тетраплоидтардан алынған гаплоидтар (2n =2х = 24) диплоидты болса, диплоидтан(2n =4х = 24) алынған гаплоидтар моноплиоидты (2n =х = 12) болады [23].
Осылайша, гаплоидия — өсімдіктер әлемі үшін көбеюдің жынысты немесе апомикті тәсілдеріне негізделген табиғи құбылыс.
Анеуплоид алуға бидай сортын (Чайниз Спринг) қара бидаймен шағылыстырғанда алынған гаплоид қолданылған. Алынған гаплоидты сол сорттың тозаңымен тозаңдандырған. Сонда тіршілікке қабілетті 13 тұқым түйінделді. Оның бесеуі мейоз кезінде 21n+1 түзейтін моносомиктер. Мейозда картиналары ажыратылатын нуллисомиктер мен моносомиктер де табылған. Моносомиктердің одан кейінгі ұрпақтарында нуллисомиктер, три-сомиктер ұрпағында тетрасомиктер табылған. Алынған нәтижелер бидай геномын генетикалық картаға түсіру жұмыстарында үлкен серпіліс берген.
Полиплоидия мәдени өсімдіктерді сұрыптау процесінде өзіндік қиындықтар туғызады. Мәселен, хромосома сандарының өсуі көптеген локустардағы әртүрлі аллельдердің көбеюіне келеді. Осының салдарынан көптік аллелизм қалыптасатын фенотиптер санының астрономиялық санға дейін өсуіне әкеледі. Мұндай жағдайда белгілі бір генотипті табу (мысалы, барлық гендері бойынша гомозиготалы) полиплоидтарда өте қиын мәселеге айналады. Мұның бәрі сандық белгілердің генетикалық талдауын, әсіресе, белгілі бір белгінің қанша генмен анықталатынын апықтауды қиындатады. Гаплоидтарды қолдану бұл күрделі сұрақты шешуді біршама жеңілдетеді [23].
Гендердің доза эфектісін зерттеу томаттың гаплоитары мен диплоидта-рында жүргізілген. Гаплоидтың морфологиялық белгілері бойынша ергежей-лікті, сары қабықты, қызыл жұмсақ және тегіс салбырамаған жемісті анықтайтын гендердің болуын анықтаған. Жемістің салбырауынан басқа барлық белгілер диплоидта да айқындалған. Бұдан жасалған қорытынды, салбырағандықты бақылайтын бір ген қандай да бір болмасын фенотиптік эффект бермейді [1].
1.2. Гаплоидия терминологиясы
Гаплоидияға қатысты генетика мен биотехнологияда қолданылатын терминологияда шатасулар бар. Мәселен, генетикада андрогенез деп жұмыртқа клеткасының, ядролық геномы аталықтікімен алмастыру процесінен түзілген гаплоидтық өсімдіктерді айтады. Мұндай өсімдіктер алшақ будандастыру кезінде екі жолмен қалыптасады: 1) тозаңдалғанан кейін белгілі бір себептермен спермия мен жұмыртқа клеткасы қосылмай қалып, тек аталық жыныс клеткалары бөлінеді, ол аналық жыныс клеткасының бөлінуі басылады; 2) тозаңдалғанан кейін жұмыртқа клеткасы мен спермия қосылады, бірақ аналық хромосомалар жойылып, нәтижесінде ядролық геномы аталық, ол цитоплазматикалық геномы аналық болып табылатын өсімдік қалыптасады. Биотехнологтар андрогенез деп – аталық гаметофитті in vitro жағдайында өсіру прцессінен түзілетін гаплоидты өсімдіктерді айтады. Бұл жағдайда өсімдіктің ядро мен цитоплазмасы тек аталық геномнан тұрады.
Аналықтың цитоплазматикалық геномы мен аталықтың ядролық геномы біріктіріліп дамуы түріне «овулярлы андрогенез» деген термин ұсынылған. Керісінше, цитоплазма мен ядролық шығу тегі аталық болса дамудың мұндай түрі үшін «микроспоралы андрогенез» термині ұсынылған [3].
С.С. Хохлов қызметкерлерімен бірге [1] басқа классификацияны ұсына-ды. Матроклинді гаплоидтар деп – ұрықтық қалта клеткаларынан немесе редукцияланған жұмыртқа клеткасынан дамыған, цитоплазмасы мен ядросы аналықтық болып келетін өсімдіктерді айтады. Мысал ретінде, ұрықтан-баған түйнектер культурасында алынған гаплоидты өсімдіктерді келтіруге болады.
Андрогенді гаплоидтар деп – жұмыртқа клеткасынан немесе ұрықтық клеткасының басқа бір клеткасынан дамыған, бірақ өзінің хромосомасы спермия әкелген хромосомамен ығыстырылған өсімдікті атайды. Мұндай гаплоидтардың екі жақты табиғаты болады. Цитоплазмасы аналық дарақтан, ал ядросы аталық дарақтан осындай гаплоидтарды алшақ гибридизация кезінде алуға болады. Андроклинді гаплоидтар деп – аталық гаметофит клеткасынан (тозаң дәнінен) дамыған және цитоплазмасы мен ядросы аталық дарақтан болатын өсімдіктерді атайды. Осындай гаплоидтардың регенерациясы аталық гаметафитті in vitro жағдайында өсіру кезінде жүреді.
Жоғарыда көрсетілген гаплоидтар типтері геномдардың саны мен сапа-сына қарай ажыратылып, соған сәйкес екі негізгі топқа, ал топ екі топ астына бөлінеді:1) бір геномды диплоидты дарақтардан шығатын; моноплоидтар немесе моногаплоидтар (М) 2) Екі немесе одан да көп бірдей (автополигаплоидтар–П1) немесе әртүрлі (аллополигаплоидтар П 2) геномдардан тұратын полиплоидты дарақтан қалыптасқан полигаплоидтар (П).
Басқа елдерде басқа терминологияларды қолданады. Оқшауланған аталық клеткалар мен ұлпалар культурасынан алынған гаплоидтар андрогенді деп, ал қалпына келу (регенерация) процесін андрогенез in vitro деп атайды. in vitro жағдайындағы гиногенез деп аналық гаметафит культурасындағы гаплоидтардың қалпына келу (регенерация) процесін атайды [4]. Осылайша, берілген терминологияда «андрогенез» бен «in vitro жағдайындағы андрогенез» ұғымдары арасындағы айырмашылықтар бар. 1-ші жағдайда ұрықтың қалыптасу процесіне келсек, аталық ядролық геном мен аналық цитоплазматикалық геном түзіледі. 2-ші жағдайда – ядролық та, цитоплазмалық та геном аталық геномы болып табылатын ұрық қалыптасуының процесінен түзіледі.
1.3. Аталық гаметофиттерден клеткалар культурасынан гаплоидтарды алу
Алғаш рет гаплоидтар тозаңдарды өсіру әдісімен S. Guha, S.C. Maheshwari 1964ж Datura іnoxia – дан алған [24]. Содан соң Y. P. Nitsch [26] Nicotiana tabacum мен Nicotiana Silvestris–тің тозаңының эмброидтарынан гаплоидты өсімдік алған. Бұл ғылыми жұмыстар тозаңдар мен микроспоралар культурасынан гаплоидты өсімдік алудың жаңа әдістерінің дамуына бастама болды. Аталық гаметофит культурасы бойынша зерттеулердің дамуы мен өсімдіктердің андрогенетикалық гаплоидтарының регенерациясы туралы 30 жылға мәліметтер 1990жылы жарық көрген Y.P.S. Bajaj –дың мақалалар жиынтығында талданған. [4]. Бұдан басқа, соңғы кездері тозаңдар мен жеке микроспораларды өсірудің, оның ішінде бидай өсірудегі табыстарға арналған моногрофиялар да шыққан [10].
Аталық гаметофит жағдайында екі еселенген гаплоидтарды алу техноло-гиясы біршама қарапайым. Өсімдіктерді жылыжайда немесе далалық жағдайда бір ядролы микроспора стадиясына дейін өсіреді. Содан кейін гүлшоғырларын жинап алады да аз уақытқа төмендетілген оң температурада сақтайды. Сосын асептикалық жағдайда гүлден тозаңқаптарды оқшаулап, алдын – ала дайындалған біріншілік қоректік ортаға егеді. Мысалға, арпа тозаңқаптарын өсіру кезінде микроскоптан көпклеткалы тозаңдық дәндерін немесе сегіз және одан да көп клеткалардан тұратын агрегаттарды байқауға болады [21] Бірнеше тәуліктен соң отырғызылған тозаңқаптан көзге көрінетін жаңадан пайда болған түзілістер пайда болады.
Тозаңқаптарды өсіру құрылымының әр түрлі типінің қалыптасуына әкеледі: глобула, эмбриоидтар, полиэмбриоидтар, морфогенді және морфогенді емес каллустар [22]. Шар тәрізді эмброид зиготалы эмбриогенезге тән барлық сатыларын: жүректәрізді, торпедотәрізді және дән жарғақты өткізеді.
Темекіде тозаңқаптан қалыптасатын эмбриоидтарды, сонымен қатар ұрықтан қалыптасқан эмбриондарды салыстырмалы зерттелген. 3 – 4 апта-дан кейін тозаңқаптың ажыраған қуысынан эмбриоидтар байқалады. Тозаңқапта эмбриогенез асинхронды өтеді. Бір мезетте эмбрионалды дамуының барлық стадияларын бақылауға болады. Бір тозаңдықтан жалғыз немесе ондаған, тіпті жүздеген эмбриоид қалыптасуы мүмкін. Олар тыныштық кезеңінсіз, қалыпты гео – және фототропикалық реакциямен өскінге дейін дамиды. Эмбрионалды даму кезінде бұзылыстар болуы мүмкін.
Lycium halimifolium – да кейбір жағдайларда жүректәрізді мен глобу-лярлы эмбриоидтары компактілі каллус түзеді, ол шексіз өсе беруге қабілетті болды. Қалыптан ауытқу тұқым жарнағының пішіні, саны және боялуы бойынша бақыланған.
Эмбриоидтардан өсімдіктердің тікелей жүруі немесе олар дедифферен-цияланып, каллус қалыптастыруы мүмкін. Глобулярлы құрылымдар дедиф-ференцияланған айнасы жоқ клеткалардың шар тәрізді тығыз шоғырлануы. Ары қарай глобула ұлпасы өледі немесе кей кездері каллусқа айналады
Дәнді дақылдардың тозаңқаптарын өсіруде негізінен 2 типті каллустың қалыптасуы жүреді. 1-гетерогенді клеткалардың ұйымдаспаған масасынан тұрады; 2- дифференцировка мен регенерацияға компетентті меристемалық клеткалардан тұрады .
Картоп тозаңын өсіруде каллустың 5 типі байқалады. [25].
1) Меристемалық ошақты каллус, ашық – қоңыр ұсақ дәнді, тығыздығы орташа. Ары қарай өсіру кезінде мұндай каллустар морфогенезге қабілетті.
2) Ашық – сары, тығыздығы орташа, дифференциялануға қабілетті, эмбриоидқа айналатын глобулярлы каллус.
3) Борпылдақ, суланған, тамырланған ризогенді каллус. Мұндай каллустар тек тамыр қалыптастыра алады және гемогенезге қабілетсіз.
4) Морфогенезге қабілеті шектеулі, ұсақ дәнді тығыз ақ каллус.
5) Қара – қоңыр дәнді каллус, борпылдақ, ірі вакуольді, ал пішіні мен
мөлшері әртүрлі клеткалары бар. Олардың көбінде ядросы жоқ. Каллустың мұндай типінің морфогенезге қабілеттілігі төмен, бірақ қоректік ортасы қолайлы болса өркен мен тамыр қалыптастырады.
Органогенез процесін жүргізу үшін эмбриоидтар мен каллустарды арнайы құрамды қоректік ортаға көшіру қажет. Мұнда өсімдіктер регенерациясы жүреді. Мұндай өсімдіктерде әдетте хромосома саны гаплоидты болып келеді. Сондықтан осындай өсімдіктердің дамуының белгілі бір сатысында диплоидты ұрықты материал алу үшін хромосомалардың санын екі еселеу процедурасын жүргізеді. Содан соң, пробиркалы өсімдікті топыраққа ауыстырып, олардың дәндерін жетілдіреді. …..