Жарық көзі ретінде ультракүлгін сәулелерді қолданған кезде оптикалық микроскоптың шешуші қабілетінің шегі

Ш.Ш.Уалиханов атындағы Көкшетау
Мемлекеттік университеті.

Химия-биология факультеті

КУРСТЫҚ ЖҰМЫС

Тақырыбы: Цитологиялық әдіс

Орындаған: 1-курс студенті
Дюсекова Мақпал
Тексерген: Б.Ғ К. Ш.Н Дүрмекбаева

Көкшетау-2007ж

Жоспар.
І Кіріспе
ІІ Негізгі бөлім
1. Цитология әдісі
2. Оптикалық микроскопиялар
3. Әдістер
IVҚортынды
VМазмұны

Цитологияның
әдістері.

Клетканың жалпы морфологиясын оқып үйрену,
зерттеу әдістерінің дамуына байланысты. Цитологияның
негізгі зерттеу әдісі микроскопиялық әдіс. Қазіргі кездің
өзінде де жарық микроскопы зерттеу құралы ретінде
өзінің маңызын жойған жоқ.

Оптикалық микроскопия

Биологиялық микроскоптың бірнеше модельдері бар. (МБИ-1, МБИ-
2, МБИ-3, МБР т.т.).
Бұл микроскоптар клеткалық құрылымдарды және олардың
функциясының Жан жақты зерттеуге мүмкіншілік береді. Ең
жақсы деген оптикалық Микроскоптың шешуші қабілеті
айтарлықтай жоғары емес. Микроскоптың шешуші
қабілеті дегеніміз жекекөрінетін екі нүктенің
ең кіші арақашықтықтары. Жарық микроскопы екі
нүктенің арақашықтықтарын өсіріп көрсетеді. Бұл
әйнек линзаларының немесе линзалар жүйесі көмегімен
іске асады.
Әйнек жүйелерінің бірі объектив, қарайтын нәрсенің
(объектінің) көрінісін құрайды, ал окуляр деп
аталатын екінші жүйе оны
қайтадан үлкейтеді. Окуляр көзге жақын орналасқан
линза (көзді латынша oculus)
дейді.
Микроскопта жарық жинаушы конденсор болады. (латынның
condensus — жинаушы деген
сөзінен шыққан). Оптикалық микроскоптың шешуші
қабілеті 0,2 мкм немесе 200 нм (нанометрге) тең, ал адам
көзінің шешуші қабілеті 0,1 мм. Жарық көзі
ретінде ультракүлгін сәулелерді қолданған кезде
оптикалық микроскоптың шешуші қабілетінің шегі 0,1
микрометрге жетеді, яғни екі есе артады.
Ультракүлгін сәулелерді адамның көзі қабылдай
алмайтын болғандықтан, клетка құрлысының көрінісі
фотоға неиесе экранға түсіріледі. Микроскоптың үлкейту
дәрежесі объектив пен окулярдың улкейтуіне тәуелді,
сан жағынан олардың үлкейту шамаларының
көбейтіндісіне тең. Қазіргі оптикалық микроскоптардың
үлкейту шегі 1500 еседен артпайды. Тірі материал
мөлдір және жеке клеткалардың калың болуына
байланысты зерттеуге қолайсыз. Сондықтан көбінесе
фиксацияланған (бекітілген)
материалмен жұмыс істелінеді. Онан жұқа кесінділер
дайындап , түрлі бояғыштармен бояйды. Қалыңдығы 5-10
мкм-дей кесіндіні арнайы микротомдар арқылы
дайындайды. Сапалы бекіту объектінің тірі куйіндегі
құрылымын айтарлықтай өзгертпейді. Бекіту ұлпаны
тығыздайды және автолиз процестерін тоқтатады. Кейбір
бекітуші сұйықтар белгілі құрылымдардың бояулар мен
боялу қабілетін арттырады. Жиі қолданылатын бекіткіштер
формальдегид, қосхромдық қышқыл калий, сірке, пикрин
және осмий қышқылдары мен этил спирті. Жақсы
бекіткіштер сұйықтар қоспалары.
Олардың көпшілігі ұсынған зерттеушілердің аттарымен аталған
(Буеннің, Карнуаның қоспалары). Бекіткеннен кейін объектіні
ұлпаға сіңетін ортаға батырады (мысалы цейлоидин немесе
парафинге). Тығыздаушы заттар жақсы сіңу үшін ұлпаның
бөлшегінен этил спиртінің көмегімен суды ығыстырып шығарады,
содан кейін ксилолға толуолға салады. Алдын ала істелетін
бұл екі кезең ұлпаға парафин сіңу үшін қажет. Жылы
сұйық парафин сіңеді де, қатып қалады. Микротомның
көмегімен парафин блогінен шыныға бекитін жұқа кесінділер
дайындайды.
Кесіндіден парафинді ксилолдың көмегімен ығыстырып шығарады.
Осыдан кейін кесіндіні бояйды. Көбінесе ұлпаны
гемотоксилин және эозинмен бояйды. Гемотоксилинмен
боялатын құрылымдарды базафилдік деп атайды.
Эозин қышқыл бояу сондықтан оны байланыстыратын
клетканың компоненттерін ацидофилдік немесе эозинафилдік
дейді. Осы құрылымдарды тірі клеткаларда белсенділік
күйінде көру үшін әртүорлі микроскоптарды шығарған:
фаза — контрастық , поляризациялық , флуоресценттік тағы
басқаларын.
Бұл микроскоптардың бәрі жарықты пайдалануға негізделген.

Интерференциялық микроскопия

Интерференциялық микроскопиялық әдіс фазалық –контрасты
микроскопия әдісіне ұқсас. Боялмаған мөлдір тірі
клеткалардың анық көрінісін алуға мүмкіншілік береді.
Жарық көзінен шығатын параллель жарық сәулелерінің шоғы
екі бұтаққа бөлінеді- үстіңгі және астыңғы. Төменгі
бұтақ препарат арқылы өтеді және оның жарық тербелісінің
фазасы өзгереді, ал жоғарғы толқын өзгермейді.
Объектінің призмасында екі бұтақ қайтадан қосылады да өзара
интерференцияланады. Осының нәтижесінде Препараттың қалыңдығы әр
түрлі участігі түрлі түске боялып жақсы көрінетін болады.
Поляризациялық микроскопия
Поляризациялық микроскопия әдісі ұлпалармен клеткалардың түрлі
компоненттерінің поляризацияланған жарықтың сынатын қабілетіне
негізделген.
Кейбір клеткалық құрылымдар (бөліну ұршығының жіптерінің ,
миофибриллалардың, жыбырлауық эпителидің кірпікшелерінің және тағы
басқа) молекулаларының қатаң дұрыс орналасуымен сипатталады
және оларға қосарланып сәуленің сыну қасиеті тән. Мұндай
құрылымдарды анизотропты құрылымдар деп атайды.
Анизотропты құрылымдарды поляризациялық микроскоптың көмегімен
зерттейді. Оның биологиялық микроскоптан айырмашылығы
конденсордың алдында поляризатор орналасқан, конденсатор мен
анализатор препаратпен объективтен кейін орнатылған.
Поляризатор мен анализатор Исландия аппатитінен жасалған
призмалар. Поляризациялық микроскопта анизатропты объектілер
қараңғы өрісте жарық шығарады. Флуоресценттік (люминсценттік)
микроскопия әдісі де тірі клеткаларды зерттеу үшін қолданылады.
Бұл әдіс кейбір заттардың жарық сәулелерінің әсерімен жарық
шығаратын қасиетіне негізделген.
Қозған жарық толқындарының ұзындығы жарық сәулелерінің
әсерімен жарық шығаратын қасиетіне негізделген.Қозған жарық
толқындарының ұзындығы жарық көзі толқындарының ұзындығынан
артық келеді. Жарық көзі ретінде көк немесе ультракүлгін
сәулелерді пайдаланады.
Клеткадағы көптеген құрылымдар мен заттардың
флуоресценцияланатын (жарық бөлетін) қабілеті болады, мысалы
өсімдіктер клеткаларының хлоропластлардағы жасыл пигмент
хлорофильдің ашық-қызыл жарық бөлетін қасиеті бар. А және В
витаминдер дебактерия клеткаларының кейбір пигменттері де жарық
шығарады. Бірақта клеткалардағы заттардың көпшілігінің бұндай
қасиеті болмайды. Ондай заттар жарық болу үшін
Флуорохромдармен, люминесценттік бояғыштармен өңдеу керек.
Бұған жататындар қызыл-сары акридин, берберин, сульфат,
флоксин, т.б. флуорохроматтардың көпшілігі жеке клеткалық
құрылымдарды жаппай бояй бермейді, таңдап бояйды және белгілі
түске. Мысалы қызғылт –сары акридин дезоксирибонуклеин қышқылын
(ДНК) жасыл, ал рибонуклейн қышқылын (РНК) қызғылт-сары
түске бояйды.
Поляризациялық микроскоптыңкөмегімен зерттелетін анизотропты
құрылымдардағы молекулалардың орналасуын анықтауға болады.

Қараңғы өрістегі микроскопия

Қараңғы өрісте препараттарды ерекше конденсатордың көмегімен
зерттейді. Жарық өрісінің конденсаторынан Қараңғы өрістік
конденсатордың айырмасы жарық көзінен жанама шеткі сәулелерін
ғана өткізеді. Жарықтың шеткі сәулелері объективке түскендіктен
Микроскоптың көру өрісі қараңғы күйінде қалады да, ал шашыраңқы
жарық түскен объекті байқалатын болады. Қараңғы өрісте түрлі
тірі клеткаларды байқауға болады.

Фазасы қарама-қарсы
Фазасы қарама-қарсы микроскопты тірі клетканы зерттеуге
қолданады. Боялмаған тірі биологиялық объектілер жарықты
сіңірмейді, түссіз мөлдір болады, яғни жарық толқынының
амплитудасын өзгертпейді.
Адамның көзі фазалық өзгерістерді байқай алмайды. Фазасы
қарама-қарсы әдісі осы болады.
Жарық микроскопының объективі мен препараттар бейнесінің айқын
көрінуін қамтамасыз етеді.
Микроскоптың бұл түрінде конденсорге арнаулы сақина тәрізді
диаграмма, объективке фазалық пластинка орнатылады. Микроскоп
оптикасының мұндай конструкциясы боялмаған препарат арқылы
өткен, көздің қабылдай алмайтын жарық фазасының өзгерістерін ,
амплитудасы әртүрлі жарық тербелісіне айналдырады. Осының
нәтижесінде препарттың бейнесі көзге анық көрінеді

Электронды микроскопия

Электронды микроскопты 1931 жылы Девиссон мен Калбин
Германияда шығарған. Клетканың біршама анық көрінісін Руска
мен Кнолль 1934 жылы алған болатын . 1950 жылы алғаш
реет ультра-жұқа кесінділер алынған. Электрондық микроскопқа
препарат дайындайтын құралды ультрамикротом деп атайды.
Электрондық микроскоптың шешімдік қабілеті өте жоғарыф.
Электрондық микроскоп жарық микроскопына қарағанда 100000 есе
артық үлкейтеді.
Қазіргі электрондық микроскоптың көрсеткіәштік қабілеттілігі 0,1-
0,3 нм-ге дейін жетеді. Объектіні 150000 есеге дейін үлкейтеді
. Клетканың барлық ультрақұрылысын молекулалық деңгейде
зерттеуге мүмкіншілік береді. Электрондық микроскоптың құрылыс
принципі жарық микроскопына ұқсас сәулелердің ролін электр
тогімен Қыздырылған вакуумда орналасқан вольфрам жібінен тарайтын
электрондар тасқыны атқарады, әйнек линзаларының орнында
электромагниттер окулярына электрондық микроскопта магниттік
катушкалар сәйкес келеді.
Электрондық микроскопына міндетті түрде вакуум болуы қажет,
себебі ауада электрондар алысқа кете алмайды, оттегі, азот,
немесе көмірқышқыл газы молекулалармен кездессе олар бөгеліп
өз жолын өзгертіп шашырап кетеді.
Электрондар тасқынының бағытын қажетіне қарай қуатты электр өрісі
немесе магнит өрісімен өзгертуге болады.
Электрондардың жылдамдығын үдетсе электронды микроскоптың шешуші
қабілеті артады. Техникалық тұрғыдан қазіргі кезде бұл қиын
мәселе емес. Токтың кернеуі 40000-100000 вольт болса, электрондар
жылдамдығы секундына 200000 км-ге дейін жетеді.
Препарат тығыз болса көрінбейді. Ең кішкене клетканың, мысалы,
бактериялық клетканың көлденң кесіндісі 1 мкм. Мұндай қалыңдықтан
ешбір электрон өтет алмайды. Сондықтан экранда қара дақ қана
Зерттелетін объектінің көрінісі электрондарға сезімтал
фотопластинкаға немесе флуоросценциялаушы экранға түседі.
Электрондық микроскоптың бірнеше түрі бар: пайда болады.
Зерттелетін клетканы өте кішкене бөліктерге кесу керек. Мұндай
кесінділердің қалыңдығы 100 нм-ден аспауы керек. Өте жұқа
кесінділерді ультрамикротомдармен дайындайды (латынша uetra
жоғары, грекше микрос-кішкене, грекше томе-кесінді). Электрондық
микроскоппен зерттеу үшін ұлпалар бөліктерін жарық микроскопымен
зерттегендей өңдеуден өткізеді. Бекітуді ерекше ұқыптылықпен
жүргізу керек, себебі микромолекулалық деңгейге дейінгі клетканың
құрылысын сақтау керек.
Көбінесе екі рет бекітуден өткізеді алдымен глутаральдегидте
немесе формальдегидте, кейін осмий ангидритінің ертідісінде
бекітеді. Сіңіру ортасы ретінде жасанды смола аралдит немесе
эпон қолданылады.
Қалыңдығы 50-100 нм кесіндіні әйнек немесе алмаз пышақтармен
дайындайды. Трансмиссиялық, растрлық, жоғары вольттік.

Авторадиография әдісі
Авторадиография әдісі метабализмдік процестердің динамикасын зерттеуге
мүмкіншілік береді. Радиоактивтік изотоптармен таңбаланған
молекулаларды, мысалы фосфордың (Р 32 ) көміртегінің (С 14 ),
сутегінің- тритийдің (Н3)изотоптарын тағамға қосып немесе
инъекция арқылы организмге енгізеді.
Сіңген радиоактивтік молекулалар клетканың белгілі бөлімдерімен
химиялық реакцияларға түседі, ал радиоизотоптардың бар жерін
авторадиография әдісімен анықтайды. Ол үшін препаратты
фотоэмульсияның жұқа қабатымен жабады. Радиоактивтік изотоптар
ыдыраған кезде бөлінетін сәулелер немесе бөлшектер эмульсия арқылы
өтіп қара түйіршіктер құрайды.

Цитохимиялық әдіс
Цитохимиялық әдістер түрлі заттардың клеткада орналасуын және
арнаулы құралдар арқылы олардың санын анықтауға мүмкіндік
береді. Бұл әдісте түрлі
Реактивтерді қолданып, клетканың құрамындағы заттарға сапалық
химиялық реакциялар жүргізеді.
Белоктарды, нуклеин қышқылдарын, майларды, көмірсуларды,
гормондарды, витаминдерді, ферменттерді, металдарды т.б.
анықтайтын әдістер бар. Цито-және гистохимиялық әдістер мұздатылған
кесінділерді бояу кезінде жиі қолданылады, бірақ та парафинді
кесінділерді бояуға пайдалануға болады. Соңғы жылдары цито-және
гистохимиялық тәсілдерді электрондық микроскопиялық әдіспен бірге
жүргізу болашағы мол жаңа бағыттың –электрондық цито-және
гистохимияның, дамуына әкеліп соқты. Қазіргі кезде
Сапалық тәсілдермен бірге ұлпалар мен клеткалардағы түрлі заттардың
мөлшерін анықтайтын сандық Цито-және гистохимиялық әдістер
қолданылып жүр. Липидтерді зерттеген кезде бекітілген ұлпаны
парафиндеуге болмайды, себебі спирттер арқылы өткізген кезде
липидтер ериді. Сондықтан оны криостатта мұздатылған күйде кесу
керек. Этил спиртінде сусыздандыру ұлпаның көлемін кемітеді.
Суды лиофилизация (мұздатылған күйінде кептіру) әдісімен жоюға
болады.
Ұлпаны тез мұздатады (мысалы: сұйық азотпен), содан … жалғасы